[发明专利] 一种高特异性的细胞分泌蛋白富集方法 – CN114075588A 全文链接一   全文链接二

 
基本信息
申请号
 CN202010745473.X
申请日
 20200729
公开（公告）号
 CN114075588A
公开（公告）日
 20220222
申请（专利权）人
 中国科学院上海有机化学研究所
申请人地址
200032 上海市徐汇区零陵路345号
发明人
 王文元;刘洁 专利类型 发明专利
摘要
 分泌蛋白组学的研究在疾病的早期诊断，以及疾病的治疗方面都有着广泛的应用。传统分泌蛋白富集方法多采用无血清培养，但这一培养方式存在种种弊端。本发明提供了一种二步法肽段层面富集的蛋白富集流程，极大的提高了该方法的特异性。同时，本发明引入了一种可以替代甲硫氨酸的非自然氨基酸——叠氮基代丙氨酸(Azidohomoalanine，AHA)来对细胞自身合成的蛋白进行标记。再结合近年来广泛应用的点击化学反应，可以高效地将修饰了炔基的生物素(biotin)加到AHA的插入位点。借助生物素这一标记，便能够实现对含血清的培养基中分泌蛋白的分离纯化及鉴定。
主权项
 1.一种特异性地富集细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：(I)提供一细胞培养体系，其中培养体系中的分泌蛋白S被第一标签T1特异性地标记，即所述细胞培养体系中含有复合物T1-S；(II)提供一可通过点击化学反应与第一标签特异性连接的第二标签T2，并使其与复合物T1-S发生点击化学反应，从而形成T2-T1-S复合物；(III)提供一结合于固相载体Z0的第三标签T3，所述第三标签T3能够与第二标签T2特异性地结合；(IV)第一富集步骤，包括子步骤：(IVa)使步骤(III)中的结合于固相载体的第三标签与步骤(II)中的T2-T1-S复合物共孵育，从而使标记有第一标签的分泌蛋白间接结合到固相载体上，从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-S；和(IVb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-S的非特异性蛋白；(V)洗脱和消化步骤，包括子步骤：(Va)将间接结合到固相载体上的分泌蛋白进行酸性洗脱，得到复合物T2-T1-S’；和(Vb)用胰酶对含有复合物T2-T1-S’的溶液进行消化反应，从而获得复合物T2-T1-P，其中P是酸性洗脱后所得到的细胞分泌蛋白经胰酶进行消化后所获得的肽段；和(VI)第二富集步骤，包括步骤：(VIa)将步骤(V)中所获得的复合物T2-T1-P与结合于固相载体Z0的第三标签T3进行第二次孵育，从而形成复合物Z0-T3-T2-T1-P；(Vb)用洗涤缓冲液洗去未形成复合物Z0-T3-T2-T1-P的特异性肽段；和(Vc)洗脱目标肽段，从而得到特异性富集的细胞分泌蛋白肽段样品。

 

 
IPC信息
IPC主分类号
 C12P21/06
C 化学；冶金

C12 生物化学；啤酒；烈性酒；果汁酒；醋；微生物学；酶学；突变或遗传工程

C12P21/06 由肽键水解产生，如水解产物（由蛋白质水解制备食品入A23J3/00）〔3〕

 

 
法律状态信息
法律状态公告日
 20220222
法律状态
 公开 法律状态信息
CN202010745473 20220222 公开 公开

 

 
代理信息
代理机构名称
 上海一平知识产权代理有限公司 31266
代理人姓名
 张璐;徐迅